献给初学者：常用的细胞核凋亡检测方法

在检验之中经常需要探测抗原质的诱发可能，这里总结了几种常见的诱发探测方规，希望只能帮到你。

一抗原质诱发的脊椎动物探测

时有发生诱发的抗原质在有机体上有一定的有机体。

光学电子显微镜和一整电子显微镜

未切开抗原质：诱发抗原质的表面积拉长、变形，抗原质膜完整但显现塑胶震荡，抗原质诱发后半期可见诱发小体。贴壁抗原质显现皱缩、变圆、脱落。

切开抗原质：常见姬姆萨切开、瑞氏切开等。诱发抗原质的肝抗原质油脂、强势，核分裂膜硫化、肝抗原质划分成块状和诱发小体等绝对值得注意的诱发有机体。

红光电子显微镜和共约定位激光扫描电子显微镜

一般以抗原质器肝抗原质的脊椎动物彻底改变为指标来面试抗原质诱发的进展可能。

常见的 DNA 特异性精油有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258（Hoechst 33258），DAPI。三种精油与 DNA 的为基础都是非嵌入式的，主要为基础在 DNA 的 A-T 碱基区。照射激发时发射器明亮的蓝色红光。

Hoechst 是与 DNA 特异为基础的来生性精油，暂存试管用蒸馏水制做 1 mg/ml 的沸点，适用时用 PBS 乙醇，终因沸点为 10 μg/ml。

DAPI 为半通透性，应用于常规固定抗原质的切开。暂存试管用蒸馏水制做 1 mg/ml 的沸点，适用终因沸点一般为 10 μg/ml。

结果面试

抗原质诱发过程之中抗原质器肝抗原质的脊椎动物彻底改变分为三期：Ⅰ 期的抗原质器呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），其余部分肝抗原质显现油脂状态；Ⅱa 期抗原质器的肝抗原质倾斜度凝聚、强势；Ⅱb 期的抗原质器硫化为碎块，导致诱发小体（示意图 1）。

透射电子电子显微镜推论

结果面试

诱发抗原质表面积拉长，抗原质质油脂。诱发Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的抗原质器内肝抗原质倾斜度直立，显现许多统称气穴震荡（citations）的空泡结构；Ⅱa 期抗原质器的肝抗原质倾斜度凝聚、强势；抗原质诱发的后半期，抗原质器硫化为碎块，导致诱发小体（示意图 2）。

二Annexin V 规

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）窄整整位于抗原质膜的下部，但在抗原质诱发的现代，PS 可从抗原质膜的下部翻转到抗原质膜的内层，暴露在抗原质外生存环境之中（示意图 3）。Annexin-V 是一种分子结构用量为 35～36 KD 的 Ca2+ 依赖性磷脂为基础抗原，能与 PS 高敏感性特异性为基础。将 Annexin-V 展开红光素（FITC、PE）或 biotin 标上，以标上了的 Annexin-V 作为红光探头，利用流式抗原质仪或红光电子显微镜可探测抗原质诱发的时有发生。

碘化丙啶（propidine iodide, PI）是一种核分裂酸精油，它不能借助完整的抗原质膜，但在诱发之中后半期的抗原质和杀抗原质，PI 只能借助抗原质膜而使抗原质器红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配适用，就可以将诱发早后半期的抗原质以及杀抗原质区分开来。

方规

悬浮抗原质的切开：将窄整整培育和诱发诱发的悬浮抗原质（0.5～1×106）用 PBS 洗脚 2 次，延入 100 μl Binding Buffer 和 FITC 标上的 Annexin-V（20 μg/ml）10 μl，常压避光 30 min，再延入 PI（50 μg/ml）5 μl，避光加成 5 min 后，延入 400 μl Binding Buffer，几天后用 FACScan 展开流式抗原质术一原理探测（一般不有约 1 h）， 同时以不延 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为中性对照。

贴壁培育的抗原质切开：先用 0.25% 的胰酶消化，净化、切开和系统性同悬浮抗原质。

爬片抗原质切开：同上，最后用红光电子显微镜和共约定位激光扫描电子显微镜展开推论。

结果

注意事项

1. 整个操作手势要尽用量柔美，切勿用力吹打抗原质。

2. 操作时注意避光，加成完毕后尽早在一小时内探测。

三真核分裂生物膜势能的探测

真核分裂生物在抗原质诱发的过程之中起着枢纽起到，多种抗原质诱发刺激因子均可诱发相同的抗原质时有发生诱发，而真核分裂生物包涵电位（Δψm）的下降，被认为是抗原质诱发级联加成过程之中最早时有发生的惨案，它时有发生在抗原质器诱发有机体（肝抗原质油脂、DNA 挤压）显现之前，一旦真核分裂生物包涵电位崩溃，则抗原质诱发随之而来。

真核分裂生物包涵电位的实际上，使一些亲脂性阳离子红光精油如 Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide（DiOC6）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide（JC-1）、Tetramethyl rhodamine methyl ester（TMRM）等可为基础到真核分裂生物内皮，其红光的增强或减弱解释真核分裂生物内膜电负性的增高或减小。

方规

将窄整整培育的抗原质和诱发诱发的抗原质延入适用终因沸点为 Rhodamine 123（1 mM）或终因沸点为 DiOC6（25 nM），JC-1（1 mM），TMRM（100 nM），37 °C 最大限度 30 min，流式抗原质不计探测抗原质的红光低压。

注意事项

1. 始终因保持最大限度染试管之中 pH 绝对值的一致性，因为 pH 绝对值的变化将阻碍电位。

2. 与精油超越最大限度的抗原质悬试管之中如果分作有抗原，他们将与其余部分精油为基础，减小精油的沸点，造成假去极化。

四DNA 视频化探测

抗原质诱发时主要的克隆有机体是其肝抗原质时有发生油脂，肝抗原质 DNA 在核分裂小体单位之间的连接处挤压，转变成 50～300 kbp 短的 DNA 成视频，或 180～200 bp 整数倍的寡核分裂酸视频，在胶状试管相上表现为梯形试管相示意图谱（DNA ladder）。

抗原质经处理事件后，采用常规方规分立制备 DNA，展开琼脂糖胶状试管相和溴化乙啶切开，在诱发抗原质群之中可推论到绝对值得注意的 DNA ladder。如果抗原质用量极少，还可在分立制备 DNA 后，用 32P-ATP 和脱氧核分裂糖核分裂酸前端赖氨酸（TdT）标上 DNA，然后展开试管相和抽射自见光，推论诱发抗原质之中 DNA ladder 的转变成。

大分子结构切开体 DNA 视频的推算出

抗原质诱发的现代，切开体挤压踏入 50～300 kbp 短的 DNA 成视频。所有有约一定分子结构用量微小的双链 DNA 分子结构在琼脂糖胶状之中的迁入反应速度相同。线性 DNA 的双螺旋运动反应速度有约胶状运动反应速度时，即超越分辨力的极限。此时胶状不再按分子结构用量的微小来筛分 DNA，DNA 像通过弯管一样，以其一端直指电场一极而通过胶状，这种迁入模式称之为「后脚」。因此，抗原质诱发掘出代导致的 50～300 kbp 短的 DNA 成视频不能用普通的琼脂糖胶状试管相来分立。

一般来说采用振幅试管相高效率可实相地解决这一情况。这个方规是在胶状上外延正交的交变振幅电场。每当电场同方向彻底改变后，大的 DNA 分子结构便滞留在后脚管之中，直至最初电场轴向重新定向后，才能在此期间向前移动。DNA 分子结构用量越大，这种重排所需要的整整就越短。当 DNA 分子结构变换同方向的整整小于电振幅长周期时，DNA 就可以按其分子结构用量微小分开。

DNA Ladder 推算出

方规

翻身抗原质（1×107）水合→抗原质硫化试管→13 000 rpm ×5 min→搜罗上清，延 1% SDS 和 RnaseA（5 mg/ml）56 °C，幼体 2 h→抗原酶 K（2.5 mg/ml）37 °C，2 h→1/10 表面积 3 mol/l 醋酸钠和 2.5 倍表面积的冷水无水乙醇水合 DNA，4 °C 半夜→14 000 rpm×15 min→最后将水合溶解在 TE buffer 之中，延 DNA Loading Buffer→1.2% 琼脂糖胶状试管相，EB 切开并照相。

结果

诱发抗原质 DNA 分作用量的流式抗原质不计系统性

方规

搜罗抗原质→70% 冷水乙醇（PBS 乙醇）4 °C 固定半夜→PBS 净化，1 000 rpm × 10 min→RNase A（0.5 mg/ml）37 °C 消化 30 min→PI（50 mg/ml）切开，常压避光 15 min→FACScan 系统性 DNA 亚基因型的转变成及抗原质长周期的变化。

结果

ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay

特点：长整整性高，适合于探测少用量样本，小其余部分诱发抗原质。如流行病学来生组织起来探测。

五TUNEL 规

抗原质诱发之中，切开体 DNA 双链挤压或单链挤压而导致大用量的水溶性 3'-OH 前端，可在脱氧核分裂糖核分裂酸前端赖氨酸（TdT）的起到下，将脱氧核分裂糖核分裂酸和红光素、甲醇酶、钠盐抗原酶或生物素转变成的酯标上到 DNA 的 3'-前端，从而可展开诱发抗原质的探测，这类方规统称脱氧核分裂糖核分裂酸前端赖氨酸酪氨酸的缺口前端标上规（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。

由于窄整整的或正在诱发的抗原质大部分没有 DNA 的挤压，因而没有 3'-OH 转变成，极少只能被切开。TUNEL 无论如何是分子结构生物学与脊椎动物相为基础的研究工作方规，对完整的单个诱发抗原质器或诱发小体展开而会切开，能准确地加成抗原质诱发绝对值得注意的生物化学和有机体有机体，可应用于石蜡包埋组织起来切开、冰冻组织起来切开、培育的抗原质和从组织起来之中分立的抗原质的抗原质有机体推算出，并可探测出极少用量的诱发抗原质，因而在抗原质诱发的研究工作之中被广泛采用。

六Caspase-3 来生性的探测

Caspase 家族在酪氨酸抗原质诱发的过程之中起着非常不可或缺的起到，其之中 Caspase-3 为关键的执行分子结构，它在诱发信号传递信息的许多都能之中展现功能。Caspase-3 窄整整以酶原（32 KD）的多种形式实际上于肠道之中，在诱发的现代阶段，它被激来生，再生的 Caspase-3 由两个大亚基（17 KD）和两个小亚基（12 KD）组成，硫化相应的肠道胞核分裂残基，最终因导致抗原质诱发。但在抗原质诱发的后半期和杀亡抗原质，Caspase-3 的来生性绝对值得注意下降。

Western blot

系统性 Procaspase-3 的再生，以及再生的 Caspase-3 及对残基多聚（ADP-核分裂糖）转录（PARP）等的硫化。

方规

搜罗抗原质→PBS 净化→抽提抗原质硫化试管→抗原一原理→SDS-PAGE 试管相→纤维素膜或 PVDF 膜转移→5% 脱脂确保安全，常压 1.5～2 h 或 4 °C 半夜→Caspase-3 多抗或类药物常压加成 1～2 h 或 4 °C 半夜→TBS-T（分作 0.05% Tween 20 的 TBS）洗脚 3 次，5～10 min/次→HRP-标上的猪抗鼠 IgG 或 AP 标上的猪抗鼠 IgG 常压加成 1～2 h→ TBS-T 洗脚 3 次， 5～10 min/次→ECL 见光或 NBT/BCIP 显色。

结果

红光分光光度不计系统性

再生的 Caspase-3 只能特异大块 D1E2V3D4-X 残基，歧化 D4-X 肽键。根据这一特点，另设不计出红光物质偶联的窄肽 Ac-DEVD-AMC。在共约价偶联时，AMC 不能被激发红光，窄肽被歧化后释抽出 AMC，自由的 AMC 才能被激发发射器红光。根据释抽的 AMC 红光低压的微小，可以推算出 Caspase-3 的来生性，从而反映 Caspase-3 被再生的程度。

方规

翻身抗原质窄整整或诱发抗原质→PBS 净化→制备抗原质硫化试管→延 Ac-DEVD-AMC（caspase-3 红光残基）→37 °C 加成 1 h→红光分光光度不计（Polarstar）系统性红光低压（激发光波短 380 nm，发射器光波短为 430～460 nm）。

结果

流式抗原质术系统性

方规

翻身抗原质窄整整或诱发抗原质→PBS 净化→延 Ac-DEVD-AMC→37 °C 加成 1 h→UV 流式抗原质不计系统性 Caspase-3 阳性抗原质数和平均红光低压。

结果

七TFAR19 抗原暗示和抗原质适配系统性

TFAR19（PDCD5）是由本研究工作室在欧美国家首先报导的一个握有自己监管机构的本能新基因，前期的功能研究工作暗示，它是促进抗原质诱发的增强剂。利用红光素（FITC）标上的 TFAR19 酵母菌为探头，对抗原质诱发过程之中 TFAR19 抗原的暗示倾斜度及适配研究工作发掘出，诱发掘出代 TFAR19 暗示倾斜度增高并显现快速核分裂可有震荡，伴随着抗原质器脊椎动物的变化，长整整较短整整，在诱发小体之中仍然可见。

同时我们发掘出，诱发掘出代 TFAR19 抗原的核分裂可有早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和抗原质器 DNA 的视频化，提示 TFAR19 抗原的核分裂可有是抗原质诱发非常现代时有发生的惨案之一。进一步的研究工作证明，诱发掘出代 TFAR19 的核分裂可有具有普遍意义，相同抗原质诱发掘出代均显现 TFAR19 高暗示和核分裂可有。这为研究工作抗原质诱发掘出代所时有发生的惨案，提供了一种最初高效率和指标。

TFAR19 抗原的抗原质适配系统性

物料试剂

FITC 标上的酵母菌，pH 7.4 、0.15 mol/L PBS，3% 的多聚甲醛，PBS-T（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 分作 0.2% Tween 20），胎牛HIV，红光抗原质洗脚试管（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 分作 2% 胎牛HIV及 0.1% NaN3），FACS 管，Tip 头，移试管器。

电子另设备

低温倾斜度离心机，37 °C 水浴箱，红光电子显微镜，共约定位激光扫描电子显微镜，流式抗原质仪。

方规

1. 悬浮抗原质的切开

（1）翻身窄整整和诱发诱发的抗原质（0.5～1×106），PBS 洗脚 2 次，1 000 rpm×10 min。

（2）3% 多聚甲醛冰浴 10 min，PBS 洗脚 2 次，1 000 rpm×10 min。

（3）延入 PBS-T 溶试管，37 °C 幼体 15 min，PBS 洗脚 2 次，1 000 rpm×10 min。

（4）延入 200 ml 胎牛HIV，常压加成 30 min。

（5）延入 5 ml FITC 标上的 TFAR19 类药物（终因沸点为 1:40），4 °C 加成 30 min。

（6）红光抗原质洗脚试管洗脚 2 次，1 000 rpm×10 min。

将抗原质水合滴片，红光电子显微镜及共约定位激光电子显微镜下推论 TFAR19 在抗原质之中的适配。同时用流式抗原质仪一原理探测 TFAR19 抗原的平均红光低压。

2. 贴壁抗原质的而会切开

（1）贴壁生短的正弦期抗原质铺在 24 盖或 6 盖支架之中（内有洁净盖玻片），让其爬片生短，待短到 50%～80 % 满时，诱发诱发剂处理事件抗原质。

（2）将相同整整点处理事件的抗原质展开免疫红光切开，切开步骤同上。

（3）将切开的爬片抗原质抽于一张滴有少用量（5 ml）的载玻片上，红光电子显微镜或共约定位激光扫描电子显微镜推论 TFAR19 在抗原质之中的适配。

3. 流行病学病理切开的切开、探测

4. 原代抗原质的培育、探测

5. 系统性 TFAR19 抗原在人体内各组织起来器官的分布及适配

TFAR19 抗原的暗示与流行病学疟疾

ELISA 规探测窄整整人和疟疾状态下，以及疟疾的相同时期，HIV之中 TFAR19 抗原倾斜度及其 TFAR19 自身HIV倾斜度。

物料和试剂

1. 都从 Buffer：pH 9.6， 0.05 mol/L 碳酸盐 Buffer

2. 净化试管： pH 7.4，0.15 mol/L PBS 分作 0.05% Tween 20

3. 确保安全试管： 3% BSA（用净化试管配制）

4. 酶标HIV的乙醇：用确保安全试管乙醇

5. OPD 残基 Buffer：Na2 HPO4·12 H2O 1.84 g，柠檬酸 0.51 g，DDW 100 ml

6. 显色试管（现配现用）：残基 Buffer 10 ml，OPD 2 mg，30% H2O2 2 ml

7. 停止试管 2 mol/L H2SO4

8. 重组人 TFAR19，HRP 标上的猪抗人 IgG9 ELISA 支架，Tip，移试管器，ELISA Reader（OD 490 nm），洗脚支架机

操作步骤

1. 用都从 Buffer 乙醇的重组人 TFAR19（1 mg/ml）都从 ELISA 支架，100 ml/well，37 °C 幼体 2 h 或 4 °C 半夜（一般 24 h 以上）。

2. 净化 Buffer 洗脚支架三次，延入确保安全试管，200 ml/well ， 37 °C 幼体 2 h 或 4 °C 半夜。

3. 净化 Buffer 洗脚支架三次，延入相同乙醇度的病症HIV（3 个重复盖）100 ml/well ，37 °C 幼体 1 h。另设都从 Buffer、净化 Buffer 、确保安全试管为中性对照。

4. 净化 Buffer 洗脚支架三次，延入 1:2 500 乙醇的 HRP 标上的抗人 IgG， 100 ml/well，37 °C 幼体 1 h。

5. 净化 Buffer 洗脚支架三次，延入显色试管，100 ml/well，避光加成 10～15 min。

6. 延入 H2SO4 停止加成，50 ml/well。

7. ELISA Reader 读取 OD 490 光密度绝对值，系统性和比较病症HIV和窄整整血 清之中 TFAR19 自身HIV的暗示倾斜度。

8. Western blot 系统性高血压抗原质和窄整整抗原质的 TFAR 19 抗原的暗示倾斜度。

的有

Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039

Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507

文章来源：大黄园站友 midas

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